Estudio funcional de las proteínas codificadas por el virus del Mal de Río Cuarto en hospedantes vegetales - Mongelli, Vanesa Claudia. (Universidad de Buenos Aires, 2010)
El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Este virus es capaz de replicar de manera persistente y no citopática en delfácidos (chicharritas) y en el floema de varias especies de gramíneas donde provoca síntomas severos y económicamente importantes. Nuestro trabajo anterior demostró que el MRCV es una especie viral independiente de las conocidas hasta el momento cuyo genoma está formado por 10 segmentos de RNA de doble cadena que codifican para 13 proteínas (PMRCVs) e identificó aquellas proteínas estructurales. Sin embargo, aún se desconoce la función de la mayoría de las proteínas virales (en particular de aquellas no estructurales) y los mecanismos moleculares que determinan el establecimiento y desarrollo de la infección. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar, definir y caracterizar la función de distintas proteínas codificadas por el MRCV a nivel molecular en hospedantes vegetales. En particular se propuso identificar las proteínas virales implicadas en el movimiento intercelular del virus dentro de la planta, en la producción de los síntomas del MRCV en plantas (determinantes de patogenicidad) y la(s) posible(s) proteina(s) con actividad supresora del silenciamiento de RNA. Este trabajo de Tesis representa el primer avance en la caracterización a nivel molecular de la función de 10 las 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) en sistemas vegetales. Para identificar proteínas del MRCV responsables del movimiento viral en plantas, se ensayó la capacidad de las distintas proteínas en estudio de complementar el movimiento de un Potato virus X (PVX) mutante, defectivo en esta función en Nicotiana benthamiana (Nb). Mediante este sistema, no fue posible identificar proteínas de movimiento entre las codificadas por el MRCV. A continuación se analizaron las características de la infección de plantas de Nb con recombinantes de PVX portando distintas secuencias codificantes para las PMRCVs. Se encontró que la expresión temprana de la proteína no estructural P7-2 produce un drástico aumento en la severidad sintomática que no es acompañado por un aumento en la acumulación viral, mientras que la expresión de P7-1 a partir del mismo vector retrasa la infección viral y reduce la severidad sintomática. Por otra parte, la presencia de los secuencias codificantes para las proteínas P9-1 (mayoritaria del viroplasma) y P10 (mayoritaria de cápside externa) en el mismo vector viral impidió el establecimiento de la infección, sugieriendo que estas proteínas podrían desencadenar una respuesta de resistencia a la infección viral en Nb. Con el objetivo de identificar proteínas del MRCV con actividad supresora del silenciamiento del RNA se utilizó un sistema modelo que se basa en la inducción del silenciamiento en plantas transgénicas que expresan GFP mediante la agroinfiltración con una cepa capaz de expresar un inductor de silenciamiento (GFP o dsGFP). Ninguna de las proteínas del MRCV evaluadas logró interferir con el silenciamiento tanto local como sistémico en este sistema. Sin embargo, mediante el uso de este sistema modelo se logró demostrar que la expresión de las proteínas no estructurales P7-1 y P7-2 codificadas por el segmento 7 del MRCV da lugar a reducciones en la acumulación del mRNA de transgenes expresados de manera transitoria o estable en un proceso que probablemente sea de origen postranscripcional. Esta actividad no había sido descripta hasta el momento para otras proteínas virales y es muy novedosa e interesante, en particular cuando se considera que la proteína P7-2 no está presente en el virus Nilaparvata lugens reovirus (NLRV) que pertenece al mismo género que el MRCV pero que es incapaz de infectar plantas. En conjunto los resultados sugieren que las proteínas P7-1 y P7-2 podrían estar implicadas en la regulación de la expresión tanto de genes virales como del hospedante durante el desarrollo de la infección del MRCV. Finalmente, al estudiar la expresión transitoria de las PMRCVs en Nb se encontró que sus niveles de expresión son bajos y que la utilización de dicotiledóneas como sistemas modelo para el estudio funcional de estas proteínas podría no ser conveniente en ciertos casos. Al analizar comparativamente el uso de codones de las PMRCVs en Nb, maíz y Nilaparvata lugens (delfácido en el que replica el NLRV), no se encontraron diferecias en el uso de codones que pudieran explicar los bajos niveles de expresión en Nb. La información y herramientas biológicas aquí generadas constituyen un gran progreso en el estudio de la actividad de las proteínas coficadas por el MRCV lo cual contribuirá al diseño de futuras estrategias efectivas de control de esta enfermedad en plantas.